当前位置:
HRU快讯:Human Reproduction中国声音|曹云霞教授团队最新成果:无创胚胎染色体筛查(NICS)——安全精准的胚胎植入前检测
来源: | 作者:szjkyyc | 发布时间: 2021-06-25 | 576 次浏览 | 分享到:


2021512日,国际生殖主流学术期刊Human ReproductionIF=5.73)在线发表了《Human Reproduction Update中文版》副主编、安徽医科大学曹云霞教授团队的研究(Non-invasive spanimplantation genetic testing for putative mosaic blastocysts: a pilot study)。该研究探究了无创胚胎种植前遗传学检测技术(ni-PGT)在染色体拷贝数嵌合的胚胎中的应用价值,为临床上ni-PGT的应用提出了新思路以及为可用胚胎有限的患者提供了新的选择。

01理清思路,确定方向

胚胎植入前遗传学检测被广泛应用于染色体异常或具有生育异常染色体后代高度倾向的染色体正常夫妇患者中,是一种有力可靠的诊断性检测手段,可以选择最具有存活价值的胚胎进行移植并预防异常染色体子代的发生。到目前为止,PGT技术已经应用于卵母细胞极体、卵裂期胚胎和囊胚滋养外胚层(trophectoderm, TE)细胞活检,被证明可以获得令人满意的妊娠结局[1]。然而,这些方法的侵袭性和有创性对活检胚胎的后续发育造成了潜在的威胁,其远期影响仍有待进一步验证。

此外,活检的显微操作需要专业的胚胎技术人员和特殊精密设备,因此增加了成本并阻碍许多中心PGT项目的广泛开展。并且TE细胞活检结果能否很好地代表整个胚胎的染色体拷贝数这一问题仍存在争议,尤其是在染色体嵌合的胚胎中,这也限制了它临床使用的可靠性。

从囊胚腔液(blastocoele fluidBF)和囊胚的培养液(spent culture mediumSCM)中提取游离DNA样本结合PGT,即ni-PGT,被认为是获得种植前胚胎遗传学信息的一种新型和可行的方法。2019年,Huang等在PNAS 上发表了一项建立在解冻囊胚续培养24 h后基础上的研究,这种方法最大程度地避免了母源性污染。此研究得出的主要结论是,培养液的niPGT-A检测可能比TE活检更可靠。他们认为培养液中的DNA可能同时来自ICMTE,而TE活检中的DNA可能只代表TE的染色体水平[2],因而游离DNA可能比TE活组织检查更有代表性,因为它可同时来自胚胎的整倍体和非整倍体细胞,因此从理论上来看,嵌合体的检测可得到某种程度的解决。对此,我们提出了一种假设,游离DNA是否对嵌合体胚胎有着更好的代表性?

02着眼临床,发现问题

首先,我们对近年来本中心的PGT-APGT-SR周期相关数据进行了分析。我们发现在临床应用过程中,染色体嵌合的发生率高达14.9%(表1)。此外,嵌合体囊胚移植的临床妊娠率与常规PGT周期的临床妊娠率相近[3]。同样,有很多研究表明,尽管嵌合体胚胎的存活率低于整倍体胚胎,但仍然是具有利用价值的[4,5]。这一发现也向临床提出了疑问,这些所谓的嵌合体胚胎究竟是真正的染色体嵌合,还是技术或人为因素导致的假阳性?

1 本中心不同时段PGT-A/ PGT-SR周期结局分析


03
缜密设计,层层推进

为初步验证ni-PGT技术的可靠性和准确性,本研究首先在8枚前次诊断为完全非整倍体的囊胚中进行解冻复苏续培14~18 h并收集激光孵化后的培养液,TE再活检和全囊胚检测样本,用MALBAC进行全基因组扩增,分析并比较不同样本之间染色体拷贝数差异。结果发现,8枚全胚胎检测结果中有7枚再次检测结果仍是非整倍体,且其中有6枚与前次检测结果出现的异常染色体一致;另外,再次检测结果中,培养液的检测结果与全胚胎检测结果(金标准)显示出100%的一致性。为了获得最高灵敏度和特异度值,我们将嵌合体胚胎的评定阈值设为50%,按照阈值进行调整后,培养液的结果仍保持与金标准结果100%的一致性(图1)。

1 A#1号胚胎,前次活检检测结果为45, XX, -22

接下来,在获取了22对之前已获成功妊娠的夫妇的知情同意后,我们用同样的方法对其41枚前次PGT检测结果为片段或整条染色体嵌合的囊胚进行解冻复苏续培14~18 h,收集胚胎培养液,TE再活检和全囊胚样本,扩增测序后同样以全囊胚检测结果作为金标准,比较不同结果之间的染色体拷贝数。41枚复苏的嵌合体胚胎中,所有的TE再活检和全胚胎样本均成功扩增,40个(97.6%)培养液样本成功扩增;其中分别有2TE再活检样本和2个培养液样本显示杂乱结果,在后续的分析中予以去除。按照前述,我们同样将嵌合体胚胎的评定阈值设为50%,并比较了ni-PGTTE再活检结果的诊断能力的各项参数(表2)。


2 培养液和TE再活检诊断能力的参数比较


   我们分析
14枚男性胚胎发现,有1枚胚胎的培养液结果和2枚胚胎的再活检结果显示X染色体重复嵌合,考虑可能由于母源性污染导致的再活检结果出现X染色体假阳性(图2)。

2 3#号胚胎的TE再活检结果显示出可疑母源性污染


04
透彻分析,阐明机制

本实验41枚嵌合体胚胎,再次检测结果显示出较高的整倍体率,提示在临床上染色体嵌合的胚胎有很高的应用价值。对于这一结果的出现,其原因可能为检测技术或胚胎自身导致的假阳性,也有可能是嵌合体胚胎自我校正的结果。例如,12#1号胚胎前次活检结果为del(mos)(2)(q14.3-q37.3)(114.47)(47%),再次检测发现全胚和再活检结果均为整倍体,而培养液出现与前次活检结果一致的染色体片段异常(图3)。

3 12#1号再次检测发现全胚和再活检结果均为整倍体,而培养液出现与前次活检结果一致的染色体片段异常

相似的结果也出现在6#2号胚胎的结果中,其前次活检结果为del(mos)(7)(p22.3-q36.3)(159.11M)(66%),再次检测提示胚胎和培养液结果片段互补(图4)。

4 6#2号胚胎前次活检结果为del(mos)(7)(p22.3-q36.3)(159.11M)(66%),再次检测提示胚胎和培养液结果片段互补

对无整倍体胚胎可用的患者,嵌合体胚胎或许可作为一种新的选择,但如预移植嵌合体胚胎,再次复苏进行无创检测尤为重要。例如,8#2号胚胎中,虽然在前次活检结果中显示为del(mos)(11)(q13.3-q25)(62.42M),且嵌合比例仅27%,但再次检测结果中,三种样本的结果均为片段非整倍体。此片段的缺失与一种名为Jacobsen综合征密切相关。这一结果提示贸然移植嵌合体即便是低比例嵌合体胚胎也存在着很大的风险。

5 8#2号胚胎的再检测结果均为11号染色体完全的片段缺失


05
春风化雨,服务临床

本研究的结果为ni-PGT的临床应用拓宽了一条新的道路。嵌合体在ni-PGT的应用中一直被认为是一个干扰因素及灰色区域。但是理论上来说,培养液中的遗传物质可能对全胚胎更具有代表性,因其同时来自滋养层和内细胞团。而传统的滋养层活检无法规避嵌合体的问题。同样,由于检测技术敏感度的日益提高,其假阳性率也会随之上升,这也就导致了一部分临床上出现的嵌合体胚胎其实并非真正的嵌合,而是一种误诊结局。由此,特别是对于那些没有整倍体胚胎可供移植的患者而言,嵌合体胚胎在经过一次解冻复苏之后,对续培培养液检测结果为整倍体的胚胎可能重新获得移植价值。ni-PGT展现了良好的检测效率和检出能力,并且无需对胚胎进行二次活检,在对胚胎的伤害降到最低的同时,最大化地利用可存活胚胎。

本文图片来源于“Non-invasive preimplantation genetic testing for putative mosaic blastocysts: a pilot study (PMID: 33974705)”一文。


研究团队简介

本研究是安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心曹云霞教授团队获得的又一项开创性成果。团队核心成员周平副教授、章志国副教授为该研究论文的通讯作者,研究团队的李欣媛硕士研究生,郝燕副教授为本文的共同第一作者。该研究得到了中央支持地方发展专项基金的支持。


通讯作者介绍


周平

安徽医科大学第一附属医院妇产科学教研室主任、生殖中心副主任。主任医师、副教授、硕士生导师。中国妇幼保健协会生育力保存专委会常委;中国医师协会生殖医学专委会委员;中华医学会生殖医学分会实验室学组成员;国家辅助生殖技术管理专家库成员;安徽省医学会生殖医学分会主任委员。主要从事生殖中心临床工作,曾作为生殖中心培养室主任,熟练胚胎培养室各项操作和管理。主持开展本中心的生育力保存和植入前遗传学诊断技术应用


章志国

博士(后),副研究员/副教授,硕导,生殖医学中心副主任、胚胎室主任;中华性医学会生殖专业委员会委员,中华医学生殖医学分会青年委员,安徽省生殖医学会委员;近20年深耕人类辅助生殖技术胚胎临床及科研一线,在体外授精、胚胎体外培养及筛选、胚胎深低温保存及胚胎遗传学检测等技术上积淀了深厚的理论功底和技术经验,此外,分别以通讯作者或第一作者发表文章于Journalof Pineal Researchprotein & cellACS Sensors Cryobiology 等国际知名学术期刊。